PRESENTATION DU
LABORATOIRE
INTRODUCTION
I.Historique
II. Ecologie
III. Caractères bactériologiques
A. Morphologie et structure
B. Caractères métaboliques
et facteurs de croissance
C. Caractères culturaux
D. Facteurs de virulence
IV. Pouvoir pathogène et immunité
V. Epidémiologie
VI. Legionella et environnement
VII. La circulaire DGS n° 98/771 du 31 décembre 1998
VIII. La norme AFNOR T 90-431 (novembre 1993)
MATERIEL ET METHODES
I. Echantillonnage
II. Matériel
III. Milieux de culture
A. Diluants
B. Milieux de culture
IV. Précautions de manipulation
V. Mode opératoire
A. Préparation de l’échantillon
- Dilution
- Concentration
B. Traitement du concentré
- Traitement thermique
- Traitement acide
C. Incubation
D. Dénombrement des Legionella
E. Repiquage des colonies caractéristiques pour confirmation
RESULTATS
I. Expression des résultats
A. Boîtes ensemencées en direct
- Une des
deux boîtes fournit un nombre exploitable de colonies confirmées
- Les deux boîtes ¬ et donnent des
nombre exploitables de colonies confirmées
B. Boîtes ensemencées après concentration
II. Les essais
DISCUSSION
CONCLUSION
PRESENTATION DU LABORATOIRE
Le laboratoire DEFRANCE est
une société privée de type SELAFA.
Il s’agit d’un groupe implanté dans 3 villes de Seine-Maritime :
Neufchâtel-en-Bray, où a été
créé le premier laboratoire par le fondateur, Monsieur DEFRANCE, en 1958. A
présent, c’est sa belle-fille, M.J. DEFRANCE qui est le Président Directeur
Général de la société.
Dans ce laboratoire, travaillent également une directrice, Madame C.REBOUL,
et deux directrices adjointes, Mesdames A DEHONGER et C.GANDELIN.
Ce sont dans ces locaux de Neufchâtel, que se font une grande part des
analyses telles que : hématologie, l’immuno-hématologie, l’immuno-enzymologie
et la recherche de protéines spécifiques.
Une première annexe a été
ouverte à Aumale en Mai 1995 par le deuxième fils du fondateur, Monsieur A.
DEFRANCE, qui en est le directeur.
Les examens de coagulation et d’électrophorèse y sont réalisés.
Le troisième laboratoire,
celui de Forges-les-Eaux, placé sous la direction de Monsieur P. BAILLY,
Pharmacien-Biologiste, a ètè inauguré le 24 Février 1997.
La bactériologie, la parasitologie, la détection par PCR de Chlamydiae trachomatis et du virus de l’Hépatite
C, et l’immunofluorescence sont les 4 domaines d’analyse de ce laboratoire.
De plus, afin de traiter les analyses biochimiques, le laboratoire DEFRANCE
s’est associé avec les Laboratoires de Saint-Pierre et du Puits-Salé formant
ainsi une Société Civile de Moyens (SCM).
INTRODUCTION
I. Historique
En 1976, à Philadelphie,
lors d’un congrès de l’American Legion, plus de 200 participants ont été
frappés par une forme de pneumonie foudroyante inconnue ; 40 morts furent
déplorés. Après une très longue et spectaculaire enquête, en janvier 1977, le
« Center for Disease Control » (CDC) d’Atlanta annonça la découverte
par Mc. Dade et son équipe d’une nouvelle espèce bactérienne responsable de
cette maladie appelée, compte tenu des circonstances « maladie des
légionnaires ». Depuis cette découverte, de nombreux travaux notamment
rétrospectifs, ont montré que cette maladie avait, en fait, déjà été observée
dans le passé, notamment à Pontiac en 1968, mais n’avait pas été identifiée
précisement . Depuis d’autres bactéries de ce type ont été découvertes et
le terme de « Légionelloses » est choisi pour désigner toutes les
infections dont elles sont responsables. Ces bactéries, les Legionella, sont rassemblées dans la
famille de Legionellaceae.
II. Ecologie
Les Legionella font partie de la flore aquatique et sont trouvées dans
de nombreux réservoirs et sources d’eaux douces, naturels ou artificiels. Elles
n’ont encore jamais été isolées dans l’eau de mer, ni dans la terre sèche ou
chez l’animal. Dans les eaux douces naturelles, elles ont été isolées à des
températures variant de 0°C à 60°C mais le plus souvent à 40°C.
En ce qui concerne les réservoirs artificiels, les Legionella ont notamment été isolées dans les systèmes de
climatisation, dans les réseaux de distribution d’eau potable (douches,
robinets...), dans des équipements médicaux chirurgicaux généralement alimentés
en eau du réseau (humidificateur). Dans tous ces systèmes, les facteurs
physico-chimiques favorables à leur survie et leur multiplication sont :
la température de l’eau, plutôt chaude (35 à 45°C), la présence de dépôts
organiques et d’autres micro-organismes (cyanobactéries, amibes libres...), la
nature des constituants du réseau sources d’éléments minéraux stimulant leur
croissance (fer, zinc, aluminium) et enfin tout élément du circuit responsables
d’une stagnation de l’eau (réservoirs, bacs de condensation, espaces morts ou
éléments obstruants d’un réseau).
Des arguments épidémiologiques et expérimentaux permettent de penser que la
transmission des Legionella se
produit à partir de sources contaminées par voie aérienne : aérosols
constitués de petites particules d’eau et de bactéries en suspension. L’aérosol
n’est infectieux que si le diamètre des particules d’eau est inférieur ou égal
à 5µm.
L pneumophila (une espèce de Legionella)
peut survivre 2h dans un aérosol dont l’humidité relative est de 65% ; les
souches virulentes survivraient mieux que les autres. De rares Legionella ont été mises en évidence
dans l’air, au voisinage d’une douche contaminée en fonctionnement. L’infection
expérimentale du cobaye par inhalation d’aérosols infectieux permet de
reproduire chez l’animal une pneumonie comparable à celle observée chez
l’homme.
III. Caractères
bactériologiques
A. Morphologie et structure
Les Legionella sont des bacilles qui mesurent 2-4 x 0,5-0,7µm avec
assez souvent des formes longues (20µm). Ils sont à Gram négatif. Ce sont des
bâtonnets droits avec un aspect en fuseau. Ils possèdent un ou parfois deux
flagelles polaires et des inclusions lipidiques. La division bactérienne se
fait par étranglement du corps bactérien. Les coupes de bactéries examinées au
microscope électronique montrent une paroi caractérisée par la présence :
- de peptidoglycane de
structure proche de celle des autres bacilles Gram négatifs, d’une membrane
externe dont l’analyse électrophorétique (SDS-PAGE) révèle chez toutes les
souches de L pneumophila la présence
d’une protéine dite majeure ayant un poids moléculaire de 29Kda ;
- d’acides gras ramifiés
cellulaires. Ces acides gras ramifiés, fréquents chez les bacilles Gram
négatifs et toujours en faible quantité. Chez les Legionella, ils arrivent à constituer jusqu'à 90% de l’ensemble des
acides gras. Cette composition est à rapprocher de celle de certaines bactéries
aquatiques thermophiles. La composition en acides gras permet de différencier
les espèces de Legionella. En effet,
chaque espèce à un profil caractéristique en chromatographie phase gazeuse des
acides gras estérifiés.
B.Caractères métaboliques et facteurs de
croissance
Les acides aminés ont un
rôle indispensable dans le métabolisme des Legionella lors de leur croissance.
Parmi les plus importants, on peut citer l’arginine, l’acide L-glutamique,
source d’énergie et la L-cystéine. L’exigence en L-cystéine, caractéristique
des Legionella, est un élément
fondamental de leur identification. Même après adaptation, la L-cystéine reste
indispensable à leur culture. La présence de fer apporté sous forme de
pyrophosphate est également nécessaire à leur croissance en particulier lors du
primo-isolement.
C.Caratères culturaux
Les Legionella sont des bactéries aérobies strictes dont la croissance
est favorisée par la présence de CO2 (2,5%), surtout lors du premier
isolement. Elles cultivent en milieu légèrement acide, pH 6,9 mais tolère des
pH inférieurs à 6,5 et même à 5,5 ; ces pH maintiendraient la cystéine,
nécessaire à leur culture, à l’état réduit. La température optimale est de 35°C
mais L pneumophila peut cultiver à
42°C et parfois même à 50°C.
Le milieu gélosé qui
convient à la culture des Légionella
est le milieu CYE (Charcoal Yeast Extract) agar à base d’extrait de levure, de
L-cystéine, de pyrophosphate ferrique et de charbon. Sur ce milieu la
croissance est visible en 3 à 7 jours à partir de produits pathologiques,
parfois plus tard. Les colonies sont grises, muqueuses, polymorphes et
présentent un aspect dit en « verre brisé » lorqu’elles sont
observées à la loupe binoculaire.
D. Facteurs de virulence
Parmi les facteurs de
virulence identifiés, certains correspondent à des constituants structuraux de
la bactérie : le LPS est une couche polysaccharidique plus ou moins
reconnue comme glycocalyx intervenant dans l’adhésion des Legionella aux substances inertes (biofilm) et à la muqueuse
respiratoire.
IV. Pouvoir
pathogène et immunité
Les légionelloses se
présentent essentiellement comme des infections pulmonaires aigües. La durée
d’incubation est de 2 à 10 jours. Après un début pseudo-grippal (fièvre, toux
sèche), le malade se présente avec un tableau sévère : température élevée,
malaises, douleurs abdominales accompagnées parfois d’importants troubles
psychiques.
L’examen clinique et la
radiographie pulmonaire mettent en évidence des signes d’atteinte pulmonaire,
parfois une pleurésie. Deux complications sont fréquentes et souvent
fatales : insuffisance respiratoire irréversible et insuffisance rénale
aigüe. IL existe des facteurs favorisants comme l’âge (moyenne de 50 ans), le
sexe (masculin), le tabagisme et l’éthylisme, les traitements
immuno-suppresseurs et les maladies sous-jacentes (cancer, diabète...). Le
pronostic peut être en relation avec certains de ces facteurs, ainsi qu’avec la
précocité du traitement antibiotique spécifique ; 10 à 15% des cas restent
mortels (20 à 30% chez les immunodéprimés). D’autres localisations ont été
observées en association ou non avec une pneumonie.
La porte d’entrée de l’agent
infectieux se situe au niveau du tractus respiratoire (inhalation d’aérosols)
et l’impact a lieu au niveau de l’alvéole pulmonaire. Les Legionella sont des bactéries à croissance intracellulaire, les
autres localisations peuvent probablement s’expliquer par une difusion
bactérienne par voie endo-bronchique, lymphatique ou sanguine ; par contre,
concernant les formes inhabituelles, le mécanisme pathogénique reste
hypothétique avec en particulier le rôle possible de toxines sécrétées par les Legionella.
A côté de ces formes
classiques ou « maladie des légionnaires », il existe une forme
bénigne dite fièvre de Pontiac caractérisée par une incubation courte (36h), un
taux d’attaque de 95%, l’absence d ‘atteinte pulmonaire et une évolution
spontanément favorable. Sa pathogénie reste inconnue.
V.
Epidémiologie
Les légionelloses observées dans tous les pays où elles
sont recherchées apparaissent sous trois formes épidémiologiques :
- anadémies (exemple :
Philadelphie en 1976, Pontiac en 1968) c’est-à-dire une contamination multiple
sans contagion interhumaine ;
- endémies (hôtels,
hôpitaux). Les situations endémiques résultent soit de retards au diagnostic,
soit de difficulté d’éradication de la source infectieuse ;
- cas sporadiques, les plus
fréquents.
Dans la forme la plus classique de légionellose, le taux
d’attaque varie selon les situations mais est en moyenne de 1,5%. Dans la forme
« fièvre de Pontiac » il est de l’ordre de 95 à 100%. Les
légionelloses s’observent toute l’année avec un pic saisonnier en été ou à
l’automne.
La voie de transmission la plus communément admise, bien que non
véritablement démontrée, est l’inhalation d’aérosols infectieux ;
cependant l’aspiration directe à partir de la flore oropharyngée a été
suspectée (intubation lors d’interventions chirurgicales, noyades) de même que
la contamination par voie digestive. L’existence de portage sain et la
contagion interhumaine n’ont encore jamais été documentées.
En raison de la diversité des méthodes utilisées, il est difficile de
connaître précisement l’incidence des légionelloses. Les Legionella seraient responsables de moins de 1% des pneumopathies
soignées à domicile, 5 à 15% de celles hospitalisées et 15 à 25% des
pneumopathies nocosomiales.
VI. Legionella et environnement
La caractère ubiquitaire des Legionella
a été reconnu parallèlement à la découverte des nouvelles espèces de
Legionella.
Des Legionella et/ou des « maladies des Légionnaires » ont été
reconnues sur tous les continents et dans tous les pays où elles ont été
cherchées.
Depuis 1976, des milliers de cas de maladies des légionnaires ont été
reconnus dans le monde entier. Son incidence annuelle est estimée à 20000 cas
aux Etats-Unis. En France, plusieurs centaines de cas ont été diagnostiqués
depuis septembre 1979 et, à Paris, la maladie des légionnaires pourrait représenter
4% des pneumopathies hospitalisées.
Dans trois pays (USA, Grande Bretagne, France) des études systématiques ont
été effectuées dans l’environnement et le résultat est identique : Legionella est un germe banal
normalement présent autour de nous.
Aux USA, Legionella est mis en
évidence dans la quasi-totalité des lacs et cours d’eau étudiés et à Paris 70%
des robinets d’eau chaude sont contaminés.
A la suite de l’anadémie de Philadelphie, les systèmes de climatisation ont
été considérés comme les principaux responsables. Actuellement, c’est l’eau qui
est à l’origine du plus grand nombre de cas, la pénétration pulmonaire du germe
se faisant par aérosolisation d’eau contaminée (douches, aérosols provoqués par
un robinet ouvert...).
VII. La
circulaire DGS n° 98/771 du 31 décembre 1998
Aussi, afin de mettre en place de bonnes pratiques
d’entretien des réseaux d’eau dans les établissements de santé, la Direction
Générale de la Santé a publié la circulaire DGS n° 98/771(page de
présentation : Annexe I) le 31 décembre 1998. Elle précise également les
moyens de prévention du risque lié aux Legionella
dans les installations à risque et dans celles recevant du public.
Ce document était devenu nécessaire à l’issue de plusieurs cas de
légionelloses communautaire ou nocosomiale apparues en 1997 et 1998.
« La qualité
microbiologique de l’eau est un paramètre essentiel de la maîtrise du risque
nocosomial. »
En effet, dans les établissemnts de santé, les personnes affaiblies sont
sensibles à une contamination de l’eau par les Legionella. Une contamination même faible par ces bactéries
constitue un réel danger sanitaire particulièrement pour les sujets atteints
d’une affection de l’appareil respiratoire ou présentant une déficience
immunitaire. Cela représente une part importante de patients.
Cette circulaire implique en particulier la mise en œuvre d’une
surveillance de la contamination des réseaux de distribution d’eau par la
recherche des Legionella sur des prélèvements effectués dans les réservoirs,
ballons d’eau, installation à risque (tours aéroréfrigérantes, installations de
conditionnement d’air...) au moins une fois par an ainsi qu’au niveau de deux points d’usage par tranche de 100 lits
(et au minimum 10 points d’usage).
Xxxx
Ces analyses doivent être effectuées en respectant la norme NF T 90-431 de
novembre 1993.
VIII. La norme
AFNOR T 90-431 (novembre 1993)
Ce document décrit une méthode générale pour la recherche
et le dénombrement des Legionella
dans les eaux. Il sert de référence dans certaines normes françaises pour
l’analyse microbiologique de type d’eaux particuliers (eaux potables, eaux de
baignade, eaux de surface, etc.) actuellement en cours d’élaboration à l’AFNOR
(Association Française de NORmalisation).
Cette méthode, faisant appel à un milieu sélectif, peut être appliquée à
tous les types d’eaux (eaux destinées à la consommation humaine, eaux chaudes
sanitaires, eaux industrielles, eaux naturelles, eaux thermales, etc.).
L’échantillon d’eau est ensemencé directement sur milieu sélectif et en
parallèle, il est filtré sur membrane en polycarbonate, de diamètre de pore
0,45µm, avec remise en suspension par grattage. Le concentré obtenu est
décontaminé, d’une part par traitement thermique, d’autre part par traitement acide.
Le concentré avant et après décontamination est ensemencé sur milieu sélectif.
Les milieux sont mis à incuber pendant 3 à 10 jours à 37°C ± 1°C. Les colonies typiques sont repiquées pour la recherche de bactéries
exigeantes en L-cystéine et la mise en évidence des Legionella.
